為什么提取植物RNA這么難？
植物RNA提取中常見的問題是提取產物的總量少，RNA質量差。植物的細胞中有很多代謝物，如蛋白質、脂質、多糖和次生代謝物等。進行RNA提取時，必須裂解細胞破壞植物膜釋放RNA，在裂解步驟中RNA不可避免會與這些代謝物混合。這些代謝物在結構上與核酸相似，會發生共沉淀反應，從而降低了RNA提取的產量和質量。抽提足夠的高質量植物RNA的難點就在于將RNA與這些代謝物進行分離。
除了代謝物豐富以外，還有一些特性也會增加植物RNA的提取難度：
1、氧化多酚類次級代謝物（如醌）可以與核酸發生不可逆的結合反應，并成為后續反應的抑制劑或降解RNA；
2、許多植物樣品存在一些固有特征，比如含有高水平RNases（會降解RNA）、由于高含水量導致RNA濃度很低，纖維組織（如木質素）難以分解和移除等。
植物RNA的提取方法
目前已經發布了數以千計的植物RNA提取方案。但大多數都基于以下三種方法：
苯酚法：主要用于具有高濃度次生代謝物的植物。苯酚通常與氯仿結合以去除多糖污染物。
Trizol法：Trizol已被用于從特定組織（如擬南芥種子）中提取RNA。Trizol是一種市售試劑，可將苯酚和異硫氰酸胍結合在單一溶液中，以便在快速分離過程中產生高產量的RNA。在這種方法中，trizol與氯仿、異丙醇和乙醇在無RNase的水中混合以去除污染物。
CTAB法：十六烷基三甲基溴化銨或基于CTAB的方法已用于提取具有高多糖、二級產物或高水平RNase的植物樣品。CTAB提取緩沖液基本上由2%十六烷基三甲基溴化銨、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl和20mM EDTA組成。這種方法首先去除多糖，然后是蛋白質，最后是次級代謝物。該方法還可以添加濃度約為0.5%的十二烷基硫酸鈉（SDS）。SDS是一種去污劑，可與蛋白質形成復合物，有助于在提取過程中去除蛋白質污染物。
植物RNA提取的主要步驟
大多數RNA提取可分為四個步驟：
1、均質化：組織可新鮮或冷凍獲取。當沒有合適的實驗室條件時（如從野外工作中收獲），樣品會在室溫下保存在高鹽溶液中，直到在實驗室處理。使用新鮮或冷凍組織時，樣本準備好后，通常將其放置在研缽中用研杵研磨成細粉（也可以使用帶有珠子的均質器）。
2、裂解：組織變成粉末后，加入裂解液。在這種情況下，可以使用苯酚、Trizol或CTAB裂解細胞以釋放RNA，這一步驟很容易產生雜質污染。這是因為當細胞膜破裂時，所有細胞內容物會同時釋放，這意味著RNA與所有其他細胞成分結合，多糖和多酚等代謝物可以與RNA更緊密地接觸。同時，RNA酶也開始發揮作用，增加了RNA降解的風險。有些提取試劑的作用類似于RNA酶抑制劑，可以減少RNA完整度受損的可能。
3、清洗：使用不同的互補試劑去除雜質，例如多糖、蛋白質和次級代謝物等。氯仿和異丙醇等試劑分別用于去除多糖/次級代謝物和蛋白質。此外，可以使用基于過濾柱或基于酶的方法去除污染的基因組DNA。
4、沉淀：純化和清洗抽提得到的RNA，進一步去除雜質，以便后續使用。70%的乙醇、0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的水或無DNase和無RNase的水都可以用來保存提取的RNA。最后，一旦RNA溶解在其中一種試劑中，必須在-80°C條件保存。
植物RNA提取關鍵試劑
在此，我們從眾多提取方案中選擇了六種非常重要的試劑/操作方法，希望可以重點關注。
裂解液：用于破壞細胞膜并促使RNA釋放。通常是Trizol、苯酚或CTAB緩沖液。
氯仿：用于去除多糖。建議使用氯仿進行兩次洗滌以獲得更好的結果。
異丙醇：去除蛋白質
乙醇：沉淀。通常RNA在70%乙醇中沉淀。
不含RNase和DNase的水：用于RNA提取的所有步驟，也可以用DEPC處理的水代替。DEPC處理水是通過將一定體積的蒸餾滅菌水與DEPC試劑（0.1%v/v）混合來制備的。
RNase：像RNaseA這樣的RNA酶是一種嘧啶特異性酶，可在胞嘧啶和尿嘧啶殘基處降解單鏈RNA。
如何測定植物RNA提取物的總量和質量
通常，有關RNA的研究旨在分析mRNA，因為它編碼蛋白質行使功能，是研究基因表達和調控的關鍵。但是，提取RNA時，會得到所有不同類型的RNA混合物。
可以通過計算μgRNA/mg組織來對RNA產物進行定量。然而，RNA定量是根據產物中占比最多的核糖體RNA進行評估的，因此，mRNA是間接地通過凝膠上的rRNA估值計算的。
如何通過估值“間接測量RNA”？
植物中的核糖體由兩個亞基組成，較大的亞基稱為28SrRNA，較小的亞基稱為18SrRNA。當這兩個亞基都存在于凝膠上時，表明RNA質量很高。如果RNA降解，其中一條條帶可能看起來模糊不清，或者兩條條帶都不會出現。
NanoDrop分光光度計是一種用于驗證獲得RNA的濃度和純度（或質量）的儀器。為了評估提取的RNA的濃度和純度，研究人員會計算230nm、260nm和280nm處的吸光度比率。
如果RNA是純的，則260/280比率預計約為2。如果該比率明顯較低，則表明存在苯酚、蛋白質或其他在280nm或附近強烈吸收的污染物。一般情況，260/230的比率，預計在2-2.2之間。如果該值相當低，則表明存在雜質（如：碳水化合物、EDTA、異硫氰酸胍和苯酚等）。低于預期的比率可能需要額外的清洗。
植物RNA提取的技巧
（1）把所有東西都放在冰上
為了抑制RNase活性，我們要確保RNA提取過程的每一步以及該過程中使用的所有工具都保持低溫。
（2）使用過濾移液器吸頭
使用非過濾移液器吸頭時，移液器筒的內部可能是污染源，而過濾器吸頭可阻止顆粒物污染。
（3）戴手套
赤手是RNases的主要來源。在RNA提取時要始終戴手套并經常更換。
（4）始終使用不含RNase/DNase的水。
可以購買不含RNase/DNase的水，也可以使用DEPC制備的溶液，該溶液的作用是使RNase酶失活，避免RNA降解。
（5）其他清洗步驟
有時根據不同的植物種類可能需要額外的清潔，例如，如果您的樣品含有大量多糖，則可以用氯仿清洗；若樣品含有大量蛋白質污染物，則可以使用丙醇清洗。
（6）基因組污染
植物 RNA 提取的過程中，DNA 也會被釋放出來，因此基因組 DNA 的去除是影響 RNA 質量的關鍵因素之一。
在使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 質量時，若存在 DNA 殘留，在 RNA 條帶上方、點樣孔下方會存在一條帶（如圖 1 所示）。DNA 殘留會對后續實驗會造成一定的影響。
解決方法：
（1）柱提法：減少樣本起始投入量，或使用脫氧核糖核酸酶 Ⅰ 進行膜上消化；
（2）細胞/組織總 RNA 提取法（Trizol 法）：向裂解液中加入氯仿后，需要在低溫下高速離心；向裂解液中加入氯仿后分層，吸取上清時避免吸到中間層和下層；
（3）若后續進行 RT-qPCR 實驗，逆轉錄時可選擇含有基因組清除模塊的產品。
（7）酚類化合物
很多植物組織特別是植物果實和樹木類植物中富含酚類物質，它的含量會隨植物的生長而增加，且針葉類植物的酚類物質含量要高于落葉類植物。
純凈的酚為無色，但易氧化為紅色至褐色的氧化產物。在提取植物 RNA 進行勻漿時，會產生「褐化效應」，酚類物質會釋放出來，氧化后勻漿液變為褐色，并且隨著氧化程度的增加而加深。被氧化的酚類化合物可與 RNA 穩定的結合，從而影響 RNA 的分離純化。
解決方法：
（1）選擇幼嫩的組織作為實驗的材料；
（2）在裂解樣品的同時加入合適的抗氧化劑。
（8）多糖物質
多糖是一種高分子聚合物，常見的多糖包括淀粉、纖維素等。植物組織中通常富含多糖，如馬鈴薯塊莖、甘薯等。多糖的許多物理性質和 RNA 相似，因此很難將其與 RNA 分開。同時在沉淀 RNA 時，多糖還會產生膠狀沉淀，影響后續的操作。另外，多糖還會抑制后續實驗的酶活性。
解決方法：
可通過鹽酸胍處理去除部分多糖；在高濃度 Na+ 或 K+ 條件下，可通過苯酚、氯仿除去部分多糖；此外還可以通過 LiCl 沉淀 RNA，將多糖留在上清。但即使通過這些步驟也還會有很大一部分多糖與 RNA 分離不開，還需要更多有效的解決辦法。
（9）蛋白質
蛋白質是影響 RNA 質量的另一重要因素。細胞均含有大量的蛋白質，同時 RNase 也屬于蛋白質，因而去除 RNA 中的蛋白質在很大程度上會影響 RNA 的提取效果。
解決方法：
（1）冷凍條件下研磨植物材料抑制 RNase 活性；
（2）裂解液中添加合適的蛋白變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等；
（3）添加適量蛋白酶 K 以消化蛋白質，再進行進一步的純化。
（10）次生代謝產物
次生代謝產物在植物對生態環境的適應上有著重要作用，其是細胞生命活動或植物生長發育正常進行的非必需小分子化合物，它的產生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性。
常見的次生代謝產物包括苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、類萜、生物堿等，這些次級代謝產物容易與 RNA 結合一起被抽提出，從而影響 RNA 的質量。
解決方法：
次生代謝產物多種多樣，且很多成分尚未完全鑒定，因此還沒有非常完整的方法來去除這些代謝產物。目前可以使用選擇性沉淀法、氯化銫梯度離心法和 RNA 回收純化法等來分離純化植物組織 RNA。
除了關注上面干擾植物 RNA 提取的因素，RNA 提取實驗作為各種分子生物學研究實驗的基礎，在實驗操作中，大家往往還會關注的是以下兩點：
提取時長：提取大量植物樣本時，事半功倍肯定是最理想的效果；
樣本兼容性：樣本涉及到簡單植物、多糖多酚植物時，能做到兼容并包是不二選擇。
（11）柱純化試劑盒和Trizol的區別
目前常用的總RNA提取方法主要分為兩類，一類是基于核酸柱純化技術的試劑盒，一類是經典的溶劑提取法，以Trizol?為代表。
柱純化法的單價較高，但是提取過程相對簡單，通常無需額外準備有害的溶劑，無需低溫離心機，新手易操作，所得RNA的質量非常高，但是樣品間的穩定性稍差，尤其是價格低的試劑盒，比較容易出現吸附柱之間的效率差異甚至出現壞柱子，對非常珍貴的樣品來說有一定的風險。
溶劑提取法試劑非常便宜，但是提取過程稍稍復雜一些，對移液的要求較高，需要低溫離心機，需要使用有害的氯仿等溶劑（Trizol試劑本身就是十分有害的），優點是樣品間的一致性很高，并且一份植物材料可以同步提取基因組DNA和總蛋白，一箭三雕。
柱純化法和溶劑法最大的區別是對小RNA的提取效率不同。除非特別強調，一般的柱純化試劑盒對小RNA的提取效率遠遠低于長片段RNA，因此普通柱純化試劑盒通常只適合蛋白表達基因的分析（100 nt以上），不適合miRNA、snRNA、4.5S rRNA、5S rRNA等小RNA分析，但是沉淀法可以有效的提取小片段RNA，適用于所有長度RNA的分析。根據實驗室的經費和儀器情況，固定選擇一種提取方法并堅持使用，兩種方法交替使用有可能對qRT-PCR的結果造成一定的波動。
（12） 采樣時的注意點
RNA極易受到RNA酶的降解，基因表達對各種環境因素的變化高度敏感。基于以上這兩點，采樣時必須要快速、低溫，樣品間盡量保持操作一致，特別是對于需要轉錄組測序的樣品，需要格外注意。
任何微小的環境因素變化，包括光照、溫度、機械震動、濕度等，都會導致某些基因的表達快速發生變化，有些基因表達響應甚至快到幾分鐘、幾十秒以內。如果樣品較多，確保有足夠多的人手能夠同時收樣，植物材料離體后迅速用大量液氮凍透，保存在-80℃冰箱，如果需要長期保存，最好添加RNA穩定劑/保存劑。
（13）樣品研磨和分裝
充分的研磨是RNA產量和質量的保證。確保整個研磨過程中植物材料從未過熱融化，所有研磨器材、器皿都用液氮時刻充分預冷，特別是分裝研磨好的粉末的時候，由于比表面積太大，極易潮解融化，大大增加了RNA降解的概率，一定要確保所有離心管和藥匙始終冷卻。
如果使用Trizol，可以按照試劑盒推薦的比例把試劑直接加到植物材料中研磨，這樣即使是室溫研磨RNA也不會發生明顯降解。
不管是使用柱純化試劑盒還是Trizol，想要確保RNA質量高，最關鍵的一點是保證足夠的液料比（裂解液：植物材料質量）。一般來說柱純化試劑盒每個純化柱能夠處理的最大樣品鮮重在100毫克，Trizol法一般也控制在每毫升提取液最多100毫克鮮重（10:1）。
如果過于貪心，想用一個純化柱推薦的裂解液體積處理200毫克材料，結果一定是令人失望的。即便擬南芥是非常容易提取RNA的材料，5:1的液料比也不會有好結果。如果植物材料富含多糖多酚，還要進一步提高液料比，20:1~40:1都是很常用的比例。
（14） 提取過程中的注意事項
對于柱純化，務必要確保每一步離心都要充分。有時因為溶液太過黏稠，離心不充分時溶液很難一下子全部通過過濾柱或者RNA吸附柱，因此要根據情況延長離心的時間以及加大離心力。最后一步乙醇洗滌之后，一定要再次離心一到兩分鐘并開蓋晾干幾分鐘徹底除去乙醇，以免影響下游反應。
對于溶劑提取法，有兩個做法可以提高RNA的質量。一是加氯仿之前，就要離心去除不溶的細胞碎片（有些品牌試劑的說明書沒有特別強調這一步，反而出于節約時間的考慮建議直接向裂解液中加氯仿萃取然后離心），然后將上清吸出后再加氯仿萃取分層。這樣做可以提高色素和蛋白的萃取效率，提高RNA純度。
二是異丙醇沉淀RNA在室溫下進行，總時間10分鐘。低溫下沉淀反而會使得某些雜質與RNA共沉淀下來，室溫沉淀有利于提高純度。不用擔心RNA降解的問題，RNA在異丙醇中非常穩定。
（15）如何應對RNA酶污染
對待RNA酶污染的態度，大抵分為兩類，一類是草木皆兵型，即便所有的器材都用高濃度DEPC處理好幾遍、采樣過程全程液氮低溫、磨樣品時液氮冷卻到手凍傷、提取過程全程戴口罩戴手套一句話也不說，還是戰戰兢兢擔心RNA會降解，仿佛哪怕旁邊的人從他身邊走過都會帶來RNA酶污染。
另一類是滿不在乎型，覺得自己什么器材都不處理，不戴口罩不用RNase滅活噴霧，全過程室溫，自己每次提出來的RNA用Nanodrop測參數也都很好。這兩種極端都不可取。嚴重的RNA酶污染并不是每次都會出現，甚至可以說非常罕見，可能幾個月幾年都遇不到一次，但是輕度的RNA酶污染其實很常見，只不過如果只用Nanodrop檢測在吸光度上沒有明顯的跡象，需要通過瓊脂糖電泳或者毛細管電泳才能發現（RIN值下降）。
所以，RNA提取實驗，對RNA酶最起碼的尊重還是要有的，器材一定要用無酶/除酶的，操作環境保持最基本的潔凈，DEPC處理一遍就可以了。但是也不至于提RNA時自己一句話也不說，還不準別人從周圍走過。如果真的發生嚴重的系統性污染，RNA一直嚴重降解，通常要考慮提取試劑、DEPC水是不是被污染，以及移液器是否發生過嚴重倒吸導致整個內部都被細菌污染。
（16）植物總RNA的特別之處
建議新手或者最近實驗環境發生較大變化的時候一定要通過電泳檢測RNA的完整性，而不是只依賴于分光光度計。教科書上一般都寫完整的RNA電泳時主要有三條帶，分別是28S、18S和5.8S三個核糖體RNA，28S rRNA的亮度大約是18S rRNA的兩倍。但是植物總RNA特別是光合組織的RNA與動物細胞總RNA相比有明顯的區別，通常至少有6條帶，且最大條帶的沉降系數與人RNA往往不一樣，通常為25S（以擬南芥為例）。
其中25S、18S和5.8SrRNA是來自于細胞質基質的80S核糖體，所有標記為綠色的23Sab、16S、5S和4.5S rRNA都來自于葉綠體70S核糖體。16S與18S對應，23S與25S對應，特別的，正常情況下葉綠體中的23S rRNA轉錄出全長前體后會裂解成兩個分子，這也就是為什么在電泳圖中看不到25S和18S之間的23S RNA，只能看到兩條比16S更小的條帶。在某些突變體中可以看到未被剪切的23S rRNA前體。
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